相比于陆生植物，微藻具有更快的生长速率和更高的光合效率，且不占用耕地，被认为是用于生产生物燃料的第三代原料[1-2]。微藻的生物质组分主要是碳水化合物、脂质和蛋白质[3]。可通过厌氧消化、厌氧发酵和生物制氢技术将微藻碳水化合物转化为甲烷、生物乙醇、生物丁醇和生物氢[1, 4]。 目前，生产富含碳水化合物微藻的方法主要有两种。第一种方法是筛选富含碳水化物的藻种，另一种方法是改变培养条件[4]。大多数微藻可通过大量营养元素(碳、氮、磷和硫)胁迫来提高碳水化合物的含量，但通常会同时导致生物量减少，从而出现含量提高了但产率没有提高的情况[4-5]。磷是所有蓝藻和真核藻类生长所必需的一种营养元素，是核酸和磷脂的基本组成元素，同时在能量传递中起重要作用[6]。已有大量研究报道，低磷胁迫下，微藻细胞生长受到抑制，蛋白质与叶绿素合成停止，碳水化合物和脂质积累增加[1, 4, 7]。如Markou等研究了螺旋藻[Arthrospira (Spirulina) platensis]在不同磷浓度下生物量及生化组成的变化，研究结果表明低磷胁迫下生物量降低而碳水化合物含量增加，同时提出碳水化合物与细胞内磷浓度成反比关系可能是由于无机磷的减少提高了ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的活性，从而促进了碳水化合物的合成[4]。硫元素是微藻细胞内许多功能性化合物，如硫脂、维生素和辅酶因子等的基本组成元素[6]。硫缺乏时，含硫氨基酸、蛋白质及其他用于生长的细胞成分合成受到抑制，细胞分裂停止，从而促进了储能化合物如碳水化合物的合成。如Yao等研究发现亚心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)随着硫浓度的减少生物量下降而淀粉含量增加[8]。此外，亚心形四爿藻蛋白质和叶绿素的含量与淀粉的含量呈负相关，表明硫限制下亚心形四爿藻可能将部分蛋白质和叶绿素降解转化为淀粉[8]。同样，White等报道了莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)无硫培养24 h后淀粉含量增加了约10倍，说明在硫缺乏条件下微藻细胞主要进行淀粉积累[9]。碳是微藻生物质的主要组成元素，约占干重的36%–65%[10]。光合自养型微藻利用光能作为能量来源固定二氧化碳合成自身有机物。溶解在水中的二氧化碳主要有CO2、HCO3−、CO32−三种形式，大部分微藻可以利用溶解于水中的CO2和HCO3–作为无机碳来源，而不能利用CO32−[11]。不同种类的微藻对二氧化碳浓度的响应不一样。如Gifuni等报道了小球藻(Chlorella sorokiniana)在二氧化碳浓度为0.5%、2.0%和5.0%时生物量没有显著性差异，但二氧化碳浓度降为0.04%或增加为10%时小球藻生物量降低，此外还发现二氧化碳浓度对淀粉的积累没有影响[12]。然而，Tang等研究了斜生栅藻(Scenedesmus obliquus SJTU)在二氧化碳浓度为0.03%、5.00%、10.00%、20.00%、30.00%及50.00%下的生长情况，结果显示二氧化碳浓度为10%时生物量最高[13]。另外，Izumo等比较克氏小球藻(Chlorella kessleri)在高二氧化碳浓度(3%)与低二氧化碳浓度(0.036%)下淀粉含量的差异，结果发现克氏小球藻在高二氧化碳浓度(3%)培养下淀粉的含量低于低二氧化碳浓度(0.036%)下的含量[14]。 标志链带藻(Desmodesmus insignis)是本实验室分离纯化的一株绿藻，属于绿藻纲(Chlorophytceae)，栅藻科(Scenedesmaceae)，链带藻属(Desmodesmus)，本实验室前期研究表明标志链带藻是一株高含碳水化合物(主要是淀粉)且沉降速度快的微藻，是用于生产生物燃料的优良原料[15-16]。另外，本实验室已研究了不同氮浓度对标志链带藻生理生化的影响，结果显示高氮培养下碳水化合物的含量比低氮限制下高[15]，与大多数研究结果相反[8, 12, 17]，表明标志链带藻可能存在独特的代谢过程。本文进一步研究其他营养因子磷、硫及二氧化碳浓度对标志链带藻生长及碳水化合物积累的影响，为利用该藻生产生物燃料奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 标志链带藻(Desmodesmus insignis)为暨南大学水生生物研究所微藻生物能源与技术实验室保藏藻株。 1.2 培养条件 以改良的BG11培养基为基础，改变其中磷酸氢二钾、硫酸镁与通入二氧化碳的浓度，设置了8种磷浓度梯度(低磷组为0.029、0.058、0.120、0.152、0.192 mmol/L，对照组0.230 mmol/L，高磷组0.460、0.920 mmol/L)，8种硫浓度梯度(低硫组：0.038、0.076、0.152 mmol/L；对照组：0.304 mmol/L；高硫组：0.609、1.217、1.824、2.432 mmol/L)，4种二氧化碳浓度水平(V/V)[0.04 (空气)、1% (对照组)、3%、5%]，每组设置3个生物学重复。使用Ø6.0 cm×60 cm的柱状光生物反应器培养，单侧24 h持续光照，入射光强为300 μmol/(m2·s)，温度为26 ℃，接种浓度为OD750=0.5，培养周期为15 d。 1.3 生物量的测定 每天取10 mL藻液，用预先烘干至恒重(W0)的0.45 μm混合纤维滤膜进行真空抽滤，再将抽滤完的滤膜烘干至恒重(W1)。生物量(DW)的计算公式如下：DW(g/L)=(W1– W0)×100。 1.4 藻粉的制备 每3 d取300 mL藻液，静置，沉淀，去上清，收集藻泥放入–20 ℃冷冻结冰，然后使用冷冻干燥机冻干，冻干的藻粉放入4 ℃冰箱中保存[15]。 1.5 碳水化合物含量的测定 采用改进的苯酚-硫酸法测定总碳水化合物的含量[15-16, 18]，称取10 mg冻干藻粉于15 mL的玻璃离心管中，加入5 mL 80%乙醇溶液40 ℃提取20 min，离心去上清，重复多次，直至藻粉变白。然后加入5 mL 0.5 mol/L H2SO4，然后100 ℃水浴4 h，离心取上清于25 mL容量瓶，定容至25 mL。取500 μL提取液，补水至2 mL，再加入1 mL 6%苯酚与5 mL 98%浓硫酸，摇匀，室温放置30 min后，于490 nm下测吸光值，然后代入标准曲线计算碳水化合物的含量。标准曲线的制作：称取10 mg葡萄糖定容于100 mL的容量瓶中，配制成100 μg/mL的葡萄糖标准液，然后吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖标准液于具塞玻璃管中，补水至2 mL，再加入1 mL 6%苯酚与5 mL 98%浓硫酸，摇匀，室温放置30 min后，于490 nm下测吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线：y=18.048x+0.0106，相关系数R2=0.9997。 1.6 总碳水化合物单位体积产率(公式1) 公式(1) 式中，B为生物量(g/L)，C为碳水化合物含量(% DW)，t为培养时间(d)。 1.7 淀粉含量的测定 采用改进的蒽酮-硫酸法[15-16]，称取10 mg冻干藻粉于15 mL的玻璃离心管中，加入5 mL 80%乙醇溶液40 ℃提取20 min，离心去上清，重复多次，直至藻粉变白。然后加入2.5 mL去离子水和3.25 mL 52%的高氯酸溶液，冰浴提取20 min，离心取上清于25 mL的容量瓶中，重复3次，然后用去离子水定容至刻度线。取200 μL提取好的样品于具塞玻璃管中，补水至1 mL，加入4 mL蒽酮试剂(0.2 g蒽酮溶解于100 mL 76%硫酸)，沸水浴10 min后，迅速放置于冷水中冷却终止反应，于620 nm波长下测定吸光值，带入标准曲线中计算淀粉含量。标准曲线：y=8.8491x+0.0074，相关系数R2=0.9997。淀粉含量=，式中OD为吸光值，M为藻粉重量(mg)，0.9为葡萄糖转淀粉的系数。 1.8 pH的测定 采用CT-6021A pH计每天测定培养基pH。 1.9 二氧化碳浓度的控制 通气采用纯二氧化碳与空气的混合气体，通过使用Cole-Parmer流量计控制通入二氧化碳与空气的流量比，实现不同的二氧化碳浓度培养条件。 1.10 数据处理 统计分析采用SPSS 20.0软件单因素方差中的LSD多重比较法，使用Excel 2010和Origin 8.5分析数据及制表绘图。 2 结果和分析 2.1 不同磷浓度对标志链带藻生物量及碳水化合物积累的影响 为了研究不同磷浓度对标志链带藻生长及总碳水化合物含量的影响，本实验设计了8种磷浓度水平，低磷组为0.029、0.058、0.120、0.152、0.192 mmol/L，对照组0.230 mmol/L，高磷组0.460、0.920 mmol/L。不同磷浓度下，标志链带藻生物量的变化如图 1所示。随着磷浓度的增加，生物量不断增加。磷浓度为0.23 mmol/L和0.460 mmol/L时，最有利于其生长，生物量分别高达6.18 g/L和6.37 g/L，磷浓度为0.029 mmol/L时生物量最低为1.17 g/L。相比于对照组(0.230 mmol/L)，降低磷浓度(除了0.192 mmol/L)生物量显著下降(P < 0.05)，磷浓度为0.029、0.058、0.120、0.152 mmol/L时的生物量分别只有对照组的1/6、1/3、1/2、5/6，但增加磷浓度生物量并无显著性变化，磷浓度为0.460 mmol/L与0.920 mmol/L时的生物量与对照组(0.230 mmol/L)的生物量没有显著性差异(P > 0.05)。 不同磷浓度下总碳水化合物的含量变化如图 2所示。培养前期(前3 d)，所有磷浓度下的碳水化合物的含量均下降，并且磷浓度越高下降的幅度越大。但随着培养时间的增加，除了低磷组0.029和0.058 mmol/L的总碳水化合物在24%左右波动外，其他磷浓度下的总碳水化合物的含量均随着培养时间的增加不断增加。磷浓度为0.230 mmol/L (对照组)，培养至15 d时，总碳水化合物含量达到最高为细胞干重的45.40%。相比于对照组，降低或增加磷浓度总碳水化合物的含量均显著性减小(P < 0.05)，培养末期磷浓度为0.029 mmol/L时总碳水化合物含量最小为细胞干重的22.1%。不同磷浓度下淀粉含量变化如图 3所示，与碳水化合物变化一致，培养至15 d，磷浓度为0.230 mmol/L时，淀粉含量最高为36.11%，进一步降低或增加磷浓度淀粉的含量均显著性减小(P < 0.05)。 不同磷浓度下总碳水化合物单位体积产率如表 1所示。磷浓度为0.029 mmol/L和0.058 mmol/L时，总碳水化合物单位体积产率随着培养时间增加而降低，而在其他磷浓度下总碳水化合物单位体积产率随着培养时间的增加先增加后降低，均在第12天时达到最大。培养前期(第3天)磷浓度为0.029 mmol/L时总碳水化合物单位体积产率最高为0.072 g/(Lˑd)，但从第6天开始0.230 mmol/L磷浓度下的总碳水化合物单位体积产率高于其他浓度下的产率，最高达0.20 g/(Lˑd)。因此，综合生物量与总碳水化合物含量考虑，磷浓度为0.230 mmol/L及培养时间为12 d时最有利于标志链带藻碳水化合物的积累。 2.2 不同硫浓度对标志链带藻生物量及碳水化合物积累的影响 标志链带藻生物量在8种不同硫浓度下(低硫组：0.038、0.076、0.152 mmol/L；对照组：0.304 mmol/L；高硫组：0.609、1.217、1.824、2.432 mmol/L)的变化如图 4所示。随着硫浓度的降低生物量降低，硫浓度为0.038 mmol/L时生物量最低为2.66 g/L。培养15 d时，硫浓度为1.217 mmol/L时生物量最高为7.02 g/L，此外0.304、0.609、1.217、1.824、2.432 mmol/L硫浓度下的生物量无显著性差异(P > 0.05)。 不同硫浓度下碳水化合物含量变化如图 5所示。各个硫浓度下总碳水化合物的含量均呈现随培养时间的增加而增加的趋势。培养前期(前6 d)，低硫组总碳水化合物含量高于其他硫浓度下的含量，第6天硫浓度为0.038 mmol/L时总碳水化合物含量最高为36.6%。但从第6天开始，高硫组总碳水化合物含量高于其他硫浓度下的含量，培养末期，硫浓度为0.609 mmol/L时总碳水化合物含量最高为51.6%。此外，硫浓度为0.609、1.217、1.824、2.432 mmol/L下的总碳水化合物含量无显著性差异(P > 0.05)，但均比对照组(0.304 mmol/L)的含量高约3%左右，而低硫(0.038 mmol/L和0.076 mmol/L)胁迫下总碳水化合物的含量显著低于对照组(P < 0.05)。培养第15天时，不同硫浓度下淀粉含量变化如图 6所示，与碳水化合物含量变化类似，低硫胁迫下，淀粉含量显著性降低(P < 0.05)，淀粉含量最高出现在高硫组，硫浓度为1.217 mmol/L时淀粉含量最高为41.49% (P < 0.05)。 不同硫浓度下总碳水化合物单位体积产率如表 2所示。硫浓度为1.824 mmol/L培养时间为12 d时，总碳水化合物单位体积产率最高为0.259 g/(Lˑd)。培养前期(前3 d)单位体积总碳水化合物产率随着硫浓度增加而降低，但从第6天起高硫组的单位体积总碳水化合物产率高于低硫组，并且随着培养时间的增加高硫组的总碳水化合物单位体积产率不断增加，而低硫组不断减少。 2.3 不同二氧化碳浓度对标志链带藻生物量及碳水化合物积累的影响 标志链带藻生物量在4种不同二氧化碳浓度(V/V)下[0.04% (空气)、1% (对照组)、3%、5%]的变化如图 7所示。1%与3%二氧化碳浓度下的生物量显著高于0.04%和5% (P < 0.05)下的生物量。培养至15 d，二氧化碳浓度为3%时生物量达到最高为6.81 g/L，此外，二氧化碳浓度为1%与3%时的生物量无显著性差异(P > 0.05)。低二氧化碳浓度(0.04%)抑制标志链带藻生长的程度比高二氧化碳(5%)大，0.04%浓度下的生物量最大仅为1.27 g/L而5%二氧化碳浓度下的生物量最大可达5.21 g/L。 4种不同二氧化碳浓度下碳水化合物的含量如图 8所示。二氧化碳浓度为3%时，碳水化合物含量最高为44.03%，其次是二氧化碳浓度为1%时碳水化合物含量为43.43%，二者无显著性差异(P > 0.05)。进一步升高或降低二氧化碳浓度碳水化合物含量均降低，0.04%和5%二氧化碳浓度下的碳水化合物含量分别为37.34%和34.64%，比对照组低6%–8%。不同二氧化碳浓度下淀粉的含量变化如图 9所示，二氧化碳浓度为1%与3%时，淀粉含量最高分别为35.49%与35.53%，二者无显著性差异(P > 0.05)。当进一步升高或降低二氧化碳浓度时，淀粉含量显著性降低(P < 0.05)。 4种不同二氧化碳浓度下总碳水化合物单位体积产率如图 10所示。随着二氧化碳浓度的增加总碳水化合物单位体积产率先增加后减少，二氧化碳浓度为3%时总碳水化合物单位体积产率达到最高为0.20 g/(Lˑd)。二氧化碳浓度为0.04%和5%的碳水化合物含量虽无显著性差异但0.04%的生物量远低于5%，从而导致0.04%的总碳水化合物单位体积产率最仅低为0.032 g/(Lˑd)。 3 讨论 本文研究了8组不同磷浓度对标志链带藻生物量与碳水化合物含量的影响，结果表明高磷组磷浓度为0.460 mmol/L时生物量最高，而碳水化合物含量最高出现在对照组0.230 mmol/L。低磷限制下标志链带藻的生长受到明显的抑制，与大多数研究结果相似[4, 19-21]。如陈爱玲等研究发现类波氏真眼点藻(Eustigmatos cf. polyphem)随着P浓度的降低生物量显著下降，表明在低P胁迫下，藻细胞新陈代谢所需要的能量减少，从而抑制了细胞分裂[21]。相比于对照组，标志链带藻在高磷浓度培养下生物量没有显著性变化。同样Yin-Hu等对栅藻(Scenedesmus sp. LX1)研究发现，持续添加磷使其维持在高磷浓度培养下生物量没有显著性变化，但培养基中磷浓度保持在一定水平，表明藻细胞可持续吸收磷但并没有全部转化为生物量，一部分多余的磷储存在细胞内[22]。另外，本实验结果显示培养末期磷浓度为0.230 mmol/L (对照组)时标志链带藻碳水化合物含量最高，而低磷胁迫下磷浓度为0.029 mmol/L时碳水化合物含量最小，这与许多研究结果相反[1, 4, 17, 22]。如Markou等研究发现螺旋藻Arthrospira (Spirulina)随着磷浓度的降低碳水化合物含量逐渐增加，低磷胁迫下碳水化合物含量最高达66.60%，而对照组只有10.99%[4]。同样Sigee等研究发现近具刺链带藻(Scenedesmus subspicatus)在低磷培养下碳水化合物的含量比在正常与高磷浓度下高[23]。通常在低磷胁迫下微藻细胞分裂受到抑制，光合作用下调，蛋白质和叶绿素合成停止，从而促进碳水化合物或脂质积累[19, 24]。但也有研究报道无磷胁迫对亚心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)碳水化合物的积累没有影响[25]。此外，Said等研究发现巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)在磷饥饿胁迫下碳水化合物含量减少，其认为可能是因为新合成的碳用于呼吸代谢或其他生物合成途径[7]。 本文研究了8组不同硫浓度对标志链带藻生物量与碳水化合物含量的影响，结果显示高硫浓度1.217 mmol/L培养下生物量最高为7.02 g/L，但与对照组无显著性差异，并且进一步增加硫浓度生物量也没有显著性变化，但随着硫浓度减少生物量显著性减少，说明低硫胁迫不利于标志链带藻的生长。同样有许多研究报道了低硫胁迫抑制微藻生长[8, 21, 26]，如Yao等研究发现当硫浓度从0.8 mmol/L降为0时，亚心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)生物量由4 g/L减少至2 g/L[8]。硫饥饿抑制细胞分裂可能是由于藻细胞缺硫情况下，一些用于生长的氨基酸、蛋白质或其他细胞成分合成受到抑制[24]。不同种类的微藻对硫的需求不一样，本实验结果表明高硫浓度下标志链带藻的生物量与对照组的生物量没有显著性差异。相反，王倩雅等研究发现产油尖状栅藻(Scenedesmus acuminatus)在2倍硫下生物量显著高于对照组，其结果表明加富硫素促进尖状栅藻细胞的生长和繁殖[26]。此外本实验结果显示8组硫浓度下标志链带藻碳水化合物的含量均随着培养时间的延长而增加，培养前期低硫组碳水化合物的含量显著高于高硫组与对照组，而培养末期高硫组碳水化合物的含量显著高于低硫组与对照组，这与大多数研究结果相反[5, 17, 26-27]。如Jerez等研究发现棕小球藻(Chlorella fusca)在初始营养盐充足情况下淀粉含量最高出现在培养前期(前3 d)，但随着培养时间延长淀粉含量逐渐减少，棕小球藻从积累淀粉转换为积累脂质，而棕小球藻在硫饥饿情况下从第3天开始光合能力下降，生长停止，淀粉逐渐积累，生长平台期时淀粉含量达到最高[5]。Zhang等研究发现莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)在低硫限制下淀粉含量提高，但随着培养时间的延长淀粉逐渐分解，分解产物用于细胞呼吸及生物氢气合成[27]。但有研究报道无硫胁迫下亚心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)碳水化合物含量没有变化[25]。由此可见，硫对微藻碳水化合物含量的影响存在种类特异性。另外，大多数微藻是通过低硫胁迫的方法来提高碳水化合物含量，但同时会引起生物量降低，从而出现碳水化合物含量提高了但产率却没有提高的情况。而本实验结果显示标志链带藻碳水化合物含量提高的同时生物量没有降低，从而产率也相应增加。 碳是藻类生物质的主要组成成分，是组成蛋白质、碳水化合物、脂质及核酸的基本成分，不同物种的微藻在不同二氧化碳浓度下的代谢能力存在差异[28]。微藻通常在二氧化碳浓度为1%–2%条件下培养[12, 15]，当二氧化碳浓度高于1%–2%时为高二氧化碳浓度培养条件，空气培养时为低二氧化碳浓度培养条件[14]。本实验结果显示标志链带藻在3%二氧化碳浓度下生物量最高，进一步提高二氧化碳浓度为5%或减少为0.04%时生物量均显著性降低。同样，Izumo等研究发现小球藻(Chlorella)在3%二氧化碳浓度下的细胞密度比在空气下高[14]。有研究报道，当pH值低于微藻适宜生长的pH范围时，生长将受到抑制，而通入空气时由于碳源不足会导致生物量降低[28]。如图 11所示，随着二氧化碳浓度增加，培养基的pH值逐渐降低，二氧化碳浓度为5%时pH值最低达5.41，表明可能由于二氧化碳浓度为5%时pH值低于标志链带藻适宜生长的pH范围而导致生物量下降。但有些微藻在较高二氧化碳浓度下生长更好，如Harwati等研究发现绿球藻(Chlorococcum sp.)在6%二氧化碳浓度下细胞密度最高，并且1%二氧化碳浓度的细胞密度与空气组的细胞密度一样[29]。此外，标志链带藻在3%二氧化碳浓度下碳水化合物含量最高，比空气组高约6%。相反，Izumo等发现小球藻(Chlorella)在空气培养下淀粉的含量比在3%二氧化碳浓度下高[14]。同样de Castro Araújo等研究发现角毛藻(Chaetoceros cf. wighamii)在空气培养下碳水化合物含量比在空气加二氧化碳培养下的碳水化合物含量高[30]。但有研究发现二氧化碳浓度对小球藻(Chlorella sorokiniana)淀粉的含量没有影响[12]。综上所述，二氧化碳浓度对微藻碳水化合物积累的影响具有物种特异性。 本文在前期研究的基础上，进一步研究了不同磷、硫及二氧化碳浓度对标志链带藻生长及碳水化合物积累的影响。结果表明，在正常磷浓度0.230 mmol/L、高硫浓度1.824 mmol/L及高二氧化碳浓度3%培养条件下最有利于标志链带藻碳水化合物的生产，不同于大多数微藻是在营养盐胁迫下积累碳水化合物，该藻是在营养盐充足情况下积累碳水化合物，其中特殊的代谢机制尚需进一步研究。
